本作劇情設定在1753年至1783年間，場景主要發生在紐約和波士頓。主角是一位叫Connor（康納）的英美混血兒，父親是英國人，母親是美國原住民。在《刺客信條3》的開局階段，玩家將體驗Conner的父親，到了第四章就會體驗康納的生活，當時他由莫霍克族（原住紐約州的印第安人）撫養長大。在英國殖民者進攻并燒毀了Conner的村莊后，他最終走上一條對抗暴政（和圣殿騎士）的道路。本作的故事仍然以刺客組織與圣殿騎士的斗爭為主線。

刺客信條3(18張)
由于故事發生在美國獨立戰爭時期，主角將會在游戲過程中遇到眾多著名歷史人物，喬治·華盛頓、本杰明·富蘭克林、查爾斯·李等人都會悉數登場。其中主角與華盛頓的互動將是本作中的核心關系之一，查爾斯·李將是本作的最終BOSS。